教程 · 结合亲和力测定

Kd 拟合教程：拟合公式、FP 实验数据处理与十个常见错误

拟合解离常数 Kd 时，最常见的问题不在软件，而在公式选错、实验条件落在公式不成立的区间。本文说明 1:1 结合的两个拟合公式从哪里来、各自什么时候成立，荧光偏振（FP）这类滴定实验的数据怎么处理，以及哪些做法会让拟合出的 Kd 不可信。文末有一个可以照着做的算例。

张霄汉 · 滑铁卢大学化学系 · 2026 年 10 月 · 配套免费工具：Kd Fitting Tool

一、Kd 的定义

对 1:1 结合 A + T ⇌ AT，解离常数定义为平衡时三种物质浓度的关系：

（1）Kd = [A][T] / [AT]

式中 [A]、[T] 是游离浓度，不是加进去的总浓度。Kd 的单位是浓度；数值越小，结合越强。当游离的 T 等于 Kd 时，恰好一半的 A 处于结合状态。几乎所有拟合错误都出在“游离浓度”和“总浓度”的混淆上。

二、两个拟合公式：双曲线与二次方程

滴定实验里，一方的总浓度保持不变，记为 F（fixed）；另一方逐步加入，总浓度记为 X。实验能控制的只有这两个总浓度，游离浓度是未知的。由质量守恒：

F = [A] + [AT]，　X = [T] + [AT]

代入式（1）消去游离浓度，得到关于复合物浓度 [AT] 的一元二次方程，取有物理意义的那个根：

（2）二次结合方程[AT] = ½ { (X + F + Kd) − √[ (X + F + Kd)² − 4XF ] }

测到的信号与复合物浓度成正比，再加一个基线：

（3）Y = Ybase + α·[AT]

其中 Ybase 是没有结合时的信号，α 是每单位浓度复合物带来的信号变化，饱和信号为 Ymax = Ybase + α·F。式（2）加式（3）就是完整的拟合模型，待定参数是 Kd、α 和 Ybase。它对任何浓度比都成立，没有做近似。

双曲线公式是它的特例

如果固定一方的浓度远小于 Kd，被结合掉的 T 可以忽略，游离 T 约等于总浓度 X，式（2）简化为大家熟悉的双曲线（Langmuir 等温式）：

（4）双曲线公式Y = Ybase + (Ymax − Ybase) · X / (Kd + X)

GraphPad 里的 “One site – Specific binding”、Origin 里的 Hyperbl，以及很多文献和教材给出的“Kd 拟合公式”，都是式（4）。它简单，但前提是 F ≪ Kd。

一个有用的关系：半饱和点

由式（2）可以严格推出，信号达到一半时对应的总浓度为：

（5）X50 = Kd + F / 2

也就是说，从曲线上读出的半饱和浓度（EC50）比 Kd 多出半个固定浓度。用双曲线公式拟合时，得到的“表观 Kd”大致就是这个 X50，相对误差约为 F / (2Kd)。

三、什么时候必须用二次方程

看固定浓度与 Kd 的比值 F / Kd：

F / Kd所处区间双曲线公式的误差该怎么做
≤ 0.1结合区≤ 5%两个公式结果一致
0.1 – 100过渡区5% 起，随比值线性增大必须用二次方程
≥ 100滴定区两个公式都定不出 Kd降低固定浓度重做

适配体、抗体这类纳摩尔级的结合，检测方法往往要求固定浓度在几十纳摩尔以上才有足够信号，F 与 Kd 处在同一量级是常态，所以直接用二次方程最稳妥：它在结合区会自动退化成双曲线，不会比双曲线差。

固定浓度越高，曲线越不反映 Kd
纵轴：固定一方处于结合状态的比例
F/Kd = 0.1F/Kd = 1F/Kd = 10F/Kd = 100
0%25%50%75%100%00.511.522.5滴加一方的总浓度 X，以固定浓度 F 为单位X = FF/Kd = 0.1F/Kd = 1F/Kd = 10F/Kd = 100
查看数据表
X / FF/Kd = 0.1F/Kd = 1F/Kd = 10F/Kd = 100
0.252%12%22%25%
0.54%22%43%49%
18%38%73%90%
1.512%50%86%98%
216%59%92%99%
2.519%65%94%99%
图 1　固定一方被结合的比例随滴加浓度的变化。F/Kd = 0.1 时曲线位置由 Kd 决定；F/Kd = 100 时曲线成为在 X = F 处转折的两段直线，改变 Kd 几乎不改变曲线。

进入滴定区后，曲线变成在 X = F 处转折的两段直线：加入多少就结合多少，直到固定一方被耗尽。此时曲线形状只由 F 决定，Kd 是 1 nM 还是 0.01 nM 画出来几乎一样，数据里没有关于 Kd 的信息。这种数据适合用来标定化学计量比或活性浓度，不能用来报 Kd，最多给出一个上限。

四、FP（荧光偏振）实验怎么拟合 Kd

直接结合的 FP 实验中，荧光标记的一方（示踪分子，通常是较小的那个，例如 FAM 标记的适配体或小分子）浓度固定，滴加未标记的结合对象。小分子转动快，偏振低；结合到大分子上后转动变慢，偏振升高。

第一步：用各向异性，不用偏振值直接加和

仪器给出的偏振 P（常以 mP 为单位，1 mP = 0.001）与各向异性 r 的换算是：

r = 2P / (3 − P)

混合体系中各向异性按各组分的荧光强度占比线性加和，偏振不严格满足这一点。偏振变化不大时两者差别很小，但换算只是一步，建议统一用 r 拟合。

第二步：对应到拟合模型

若结合前后荧光强度不变，观测到的各向异性是游离态与结合态的加权平均：

r = rf + (rb − rf) · [AT] / F

这正是式（3）：Y = r，Ybase = rf（示踪分子单独存在时的各向异性），α = (rb − rf) / F。所以把 F 设为示踪分子的总浓度，X 设为滴加一方的总浓度，直接用二次方程拟合 r 对 X 的数据即可。rf 可以独立测得，适合作为固定基线。

第三步：检查荧光强度有没有变

很多荧光团在结合后强度会变（淬灭或增强）。这时结合态和游离态对总信号的贡献不再按浓度比例计算，直接拟合 r 会使曲线偏移。设 Q 为结合态与游离态的荧光强度之比，结合分数应按下式计算：

fb = (r − rf) / [ (r − rf) + Q · (rb − r) ]

先把每个点换算成 fb，再以 fb 为信号拟合（此时 Ybase = 0，α = 1 / F）。Q 可以由饱和点与滴定起点的总荧光强度之比得到。强度变化超过一成左右时，建议做这一步校正。

示踪分子浓度怎么选

在信号足够稳定的前提下，示踪分子浓度越低越好，最好不高于预期的 Kd。如果仪器灵敏度决定了只能用高于 Kd 的浓度，就必须用二次方程，并确认 F / Kd 没有超过 100。竞争型 FP（测 IC50 再换算 Ki）涉及三组分平衡，需要另一套公式，不在本文范围内。

五、算例：同一组数据，两个公式差 50%

固定 50 nM 荧光标记适配体，滴加靶标，记录荧光信号。数据如下（与 Kd Fitting Tool 页面的算例相同）：

靶标总浓度 X（nM）0102550100200400800
信号 Y（a.u.）10201180139516602010236026002730

用两个公式分别拟合，三个参数都自由：

模型Kd（nM）标准误R²残差均方根
二次方程，式（2）+（3）63.2± 1.30.99995.0
双曲线，式（4）95.3± 5.40.999118.0

二次方程给出 Kd ≈ 63 nM，双曲线给出 95 nM，高出约 51%。这与式（5）的预期一致：半饱和点在 Kd + F/2 = 63 + 25 = 88 nM，双曲线拟合出的表观 Kd 落在这附近。两个 R² 都在 0.999 以上，单看 R² 分不出哪个公式用错了。

二次方程拟合：Kd = 63 nM
固定 50 nM 适配体；纵轴为荧光信号（a.u.）
1,0001,5002,0002,5003,0000101001,000靶标总浓度 X（nM，对数刻度）半饱和点：X = 88 nM = Kd + F/2Kd = 63 nM
查看数据表
X（nM）实测 Y二次方程拟合值双曲线拟合值
010201,0251,001
1011801,1811,188
2513951,3851,409
5016601,6581,677
10020102,0182,007
20023602,3602,331
40026002,5972,587
80027302,7312,755
图 2　黑点为实测数据，曲线为二次方程的拟合结果（Kd = 63.2 nM，Ybase = 1025，Ymax = 2874）。零浓度点画在断开的坐标轴左侧。
残差对比：模型用错时，残差不随机
纵轴：实测信号 − 拟合值（a.u.）
二次方程双曲线
−30−150+15+300102550100200400800靶标总浓度 X（nM），每个浓度一格双曲线二次方程
查看数据表
X（nM）二次方程残差双曲线残差
0−5.3+18.7
10−0.7−7.8
25+9.8−14.4
50+1.7−17.0
100−7.6+3.4
200+0.1+29.1
400+3.3+13.3
800−1.4−25.3
图 3　残差 = 实测 − 拟合。二次方程的残差都在 ±10 以内，正负交替；双曲线的残差大到 +29.1，而且连续几个点同号，这是模型不对的标志，R² 看不出来。

在工具里照着做

  1. 打开 Kd Fitting Tool，在参数面板把 Fixed concentration 设为 50，单位设为 nM。
  2. 把上表前两列（靶标浓度、信号）从 Excel 复制，粘贴到主数据表。
  3. 如果空白对照的信号已单独测得，填入固定 Ybase；否则以自由拟合的结果为准。
  4. 点击开始拟合，得到 Kd、Ybase、alpha 与拟合曲线，可导出 CSV 或图片。

工具全程在浏览器本地运行，数据不上传。拟合出的 Kd 低于固定浓度的 1% 时，工具会提示数据落在滴定区、Kd 不可辨识。

六、十个常见错误

  1. 把总浓度当作游离浓度，套用双曲线公式

    固定浓度与 Kd 同一量级时，相当一部分滴加物被结合掉，游离浓度明显低于总浓度。双曲线公式会把 Kd 高估约 F / 2。

    做法：用二次方程；或把固定浓度降到 Kd 的十分之一以下。

  2. 固定浓度远高于 Kd，数据落在滴定区

    曲线呈两段直线，在 X = F 处转折。优化器会给出一个很小的 Kd 和漂亮的 R²，但这个数没有意义。

    做法：降低固定浓度重做，直到曲线出现弯曲的过渡段；做不到时只报告上限，例如 Kd < F / 100。

  3. 没有滴到饱和

    上平台没有出现时，Ymax 和 Kd 高度相关：Ymax 估高一点，Kd 就跟着变大，两组参数拟合得一样好。

    做法：最高浓度至少达到 Kd 的 10 倍（饱和度约 91%）；受溶解度或成本限制达不到时，说明这一点并给出置信区间。

  4. 用线性化作图求 Kd

    Scatchard、双倒数、Benesi–Hildebrand 作图是计算机普及之前的办法。取倒数会放大低浓度点的误差，直线回归的权重随之失真；多数线性化形式还默认了游离浓度等于总浓度。

    做法：直接对原始的浓度—信号数据做非线性最小二乘拟合。线性化图只用于展示，不用于求参数。

  5. 基线处理随意

    常见的做法有两种，都有风险：一是把所有点减去零浓度点后强制曲线过原点，等于把一个带噪声的测量值当成了精确值；二是把基线固定在一个不是实测的数上。

    做法：基线有独立、重复的测量（如只有缓冲液的空白）时固定它，否则让它参与拟合。两种结果差距很大，说明数据不足以确定基线。

  6. 浓度点太少，或都挤在一头

    等差稀释会把大部分点放在饱和区；只有四五个点时，三个参数的拟合几乎没有自由度。

    做法：按等比（如 2 倍或 3 倍）稀释，覆盖 Kd 的 0.1 倍到 10 倍，8 到 12 个浓度，加上零浓度点；转折附近多放几个点。

  7. 单位或实际浓度出错

    X 与 F 必须用同一单位，Kd 的单位随之确定。更隐蔽的问题是名义浓度不等于有效浓度：蛋白的活性分数、适配体正确折叠的比例、移液与吸附损失，都会让实际的 F 偏离计算值，而二次方程对 F 是敏感的。

    做法：用吸光度等方法标定储备液浓度；怀疑活性分数不足时，用滴定区的实验标定有效浓度。

  8. 只看 R²

    结合曲线是平滑的单调曲线，用错模型同样能得到 0.999 以上的 R²。上面的算例里双曲线拟合 R² 为 0.9991，Kd 却高了约 50%。

    做法：看残差是否随机分布，看 Kd 的标准误或置信区间，并与独立重复实验的结果比较。

  9. 随意加 Hill 系数

    给公式加一个指数 n 总能让曲线贴得更紧，但没有机理依据的 n ≠ 1 不代表协同结合。配体耗尽、没有达到平衡、浓度误差，都会使曲线变陡或变缓。

    做法：先排除上述实验原因；只有化学计量和机理支持多位点协同时，才使用 Hill 方程，并说明理由。

  10. 没有达到平衡

    Kd 是平衡常数。对 1:1 结合，趋于平衡的速率常数为 kon·[T] + koff，浓度越低平衡越慢，结合越强（koff 越小）所需时间越长。孵育时间不够时，低浓度点的信号偏低，Kd 被高估。

    做法：取最低的几个浓度做时间进程，确认信号不再变化；孵育时间至少为 5 个半衰期。

七、报告 Kd 时应写明什么

  • 拟合模型（二次方程还是双曲线）以及固定一方的浓度。
  • 缓冲液组成、离子浓度、温度与孵育时间。适配体的 Kd 对 Mg²⁺、K⁺ 浓度尤其敏感。
  • Kd 及其标准误或置信区间，基线是固定还是自由拟合。
  • 独立重复的次数，以及误差棒的含义（标准差还是标准误）。
  • 拟合曲线与原始数据点画在同一张图上，最好附残差。
  • 所用软件或工具及版本。

八、常见问题

Kd 拟合公式是什么？

1:1 结合的通用公式是二次结合方程，即上文式（2）与式（3）。只有固定一方的浓度远小于 Kd（F ≤ 0.1 Kd）时，才能简化为双曲线公式（4）。

FP 实验怎么拟合 Kd？

把荧光标记一方的浓度作为固定浓度 F，滴加另一方并记录各向异性 r，用二次方程对 r 和滴加方总浓度做非线性拟合。结合前后荧光强度变化明显时，先按强度比 Q 把 r 校正为结合分数，见第四节。

为什么不用双倒数或 Scatchard 作图？

线性化变换会扭曲测量误差，低浓度点的误差在取倒数后被放大。直接做非线性最小二乘拟合，误差结构不变，Kd 与置信区间更可靠。

R² 很高是不是就说明 Kd 可靠？

不是。模型用错时 R² 同样可以超过 0.999。应同时检查残差是否随机分布，以及 Kd 的标准误或置信区间。

Kd 和 EC50 有什么区别？

EC50 是信号达到一半时滴加一方的总浓度，取决于实验条件；Kd 是平衡常数。对 1:1 结合，EC50 = Kd + F / 2，只有 F 远小于 Kd 时两者才近似相等。

等温滴定量热（ITC）或 SPR 的数据能用这个公式吗？

不能直接用。ITC 拟合的是每次注射的热量，需要考虑稀释与体积变化；SPR 通常拟合动力学曲线或稳态响应，表面固定一方的浓度概念也不同。本文的公式适用于溶液中、信号与复合物浓度成正比的平衡滴定，例如荧光强度、荧光偏振、吸光度和 FRET。

Kd Fitting Tool：按本文的二次结合方程拟合，同时给出基线自由与基线固定两组结果，支持重复数据误差棒，可导出曲线与图片。网页工具，无需安装，数据不上传。

打开拟合工具 →

参考文献

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  5. Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed., Springer (2006), Chapter 10: Fluorescence Anisotropy.

引用本文或工具：Zhang, X. (2026). Kd Fitting Tool (Version 0.24) [Computer software]. https://zxiaohan.com/research/tools/kd-fit/